新闻中心
噬菌体解聚酶在对抗生物膜中的作用
日期：2023-02-21
1 生物膜
1.1 生物膜的组成和形成
生物膜是一个生活在胞外基质（extracellularpolymeric substances，EPSs）中的微生物群落，EPS由DNA（＜1%），RNA（＜1%），结构蛋白（1~60%），脂质（1~40%），酶，一种或多种胞外多糖（40~95%）组成。这些物质不仅可以防止细菌被捕食还可以避免各种物理、化学和生物因素的侵害，帮助细菌在恶劣的环境中生存。生物膜的体积（通常为2-35％）由微生物本身构成，其中的通道可将水、空气和营养物运输到该结构的所有部分（见图1a）。
生物膜的形成是一个复杂的过程。首先细菌借助范德华力以及菌毛或鞭毛将微生物附着在有生命或无生命的表面上，然后细菌形成单层并产生细胞基质以固定自身。接着，通过EPS内的特定化学信号启动微生物细胞的增殖和分裂，这种作用的结果是微菌落形成三维结构。紧接着，一层层的细胞和小簇形成薄的生物膜，生物膜的结构逐渐成熟和形成。团簇逐渐发展成大的微菌落，许多细胞从基质中移出形成通道和空隙。在生物膜形成的最后阶段，微生物细胞上调编码与鞭毛形成有关的蛋白质的基因表达，从而使细菌移动到新的位置，生物膜中的细菌开始快速繁殖，分离和分散。这个过程促使细菌扩散到新的表面上并定殖（见图1b）。
图1 生物膜的组成(a)和形成过程(b)（引自文献1）
1.2 生物膜的危害
生物膜广泛存在于各种细菌中，它的形成对人类健康构成很重要的威胁。美国国立卫生研究院（NIH）发现，人体中约80%以上的微生物感染与生物膜有关，大部分慢性感染疾病也与生物膜相关。若在医疗器械、假体、输液管、内窥镜和导尿管以及伤口上发现生物膜，微生物很容易从这些表面传播给患者并造成更严重的感染。同时与浮游生物（未形成生物膜的细菌）相比，生物膜群落中的细菌对抗生素的敏感性降低了约1000倍。不仅如此，生物膜还能抵抗宿主免疫系统，防腐剂，消毒剂等。
1.3 对抗生物膜的策略
最常见的治疗生物膜感染的方法是清理被污染的设备（如植入的医疗设备）或去除形成的生物膜，见图2。
图2 对抗生物膜的策略（引自文献1）
2 噬菌体衍生物
噬菌体的衍生物主要是指噬菌体基因编码的一些蛋白，如肽聚糖水解酶（peptidoglycanhydrolases, PGH）又称为内溶素（Endolysin）或裂解酶（lysin）。内溶素的主要作用是降解细菌的肽聚糖从而使细菌细胞破裂释放出新包装完成的噬菌体颗粒。有一些噬菌体编码另一种类型的PGH---病毒体相关肽聚糖水解酶（virion-associated peptidoglycan hydrolase, VAPGH），VAPGH在感染过程中局部降解肽聚糖，使细菌细胞壁的渗透性发生改变。某些噬菌体还能编码多糖解聚酶（polysaccharide depolymerases），主要功能是降解细菌细胞壁被膜中大分子碳水化合物。胞外多糖可保护细菌免受干燥、抗生素、宿主免疫系统的侵蚀，而解聚酶可帮助病毒颗粒吸附，侵入和裂解宿主菌，即使在生物膜中，解聚酶也能发挥很好的作用。孔蛋白（Holin）主要负责破坏细胞质膜，从而协助细胞内溶素溶解。
图3 各种酶类示意图（引自文献2）
2.1 多糖解聚酶
许多噬菌体会编码多糖水解酶（解聚酶），从而降解细菌细胞周围的细胞外多糖和脂多糖（LPS）中的大分子碳水化合物。解聚酶仅在有尾双链DNA中报道，这可能与它们的尾部结构（尾钉蛋白，Tailspikeprotein, TSP）或可扩散的酶有关。Pires等人报道解聚酶一般位于噬菌体基因组中的结构基因区域（如尾部纤维或基板）或其附近。这些噬菌体编码的酶识别、结合和消化细菌细胞壁的多糖化合物，这些结构降解后可暴露出噬菌体受体，这对于噬菌体能有效感染宿主至关重要。根据解聚酶的作用机理，可将其分为两类：水解酶和裂解酶。两者都能降解生物膜形成中的多糖，包括荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、O多糖或胞外多糖（EPSs），有些解聚酶还能降解多肽或脂质。噬菌体水解酶主要具有唾液酸酶，木糖苷酶，乙酰化酶，鼠李糖苷酶，葡聚糖酶和肽酶的活性，这组酶属于O-糖基水解酶，可催化糖苷键的水解。另一类解聚酶以透明质酸盐，藻酸盐和果胶/果胶裂解酶为代表，它们的解聚机理基于β-消除作用形成新的双键。
自从发现解聚酶的活性后，它便成为抗生素的替代品，特别是在多重耐药菌的治疗中。与抗生素不同，解聚酶对宿主具有特异性，不会影响天然细菌菌群。它们不仅可以进行工程改造以提高其降解活性，还可以用作检测细菌的工具。解聚酶可以两种形式使用（1）病毒分子组分的含有解聚酶结构域的尾部蛋白，（2）游离酶类。当使用整个噬菌体时，它们可以在敏感的宿主细胞中繁殖，并产生更多带有TSPs的病毒体，通过噬菌体可将这些酶类送到靶向的部位，这对于临床治疗生物膜感染有很大的帮助。然而，噬菌体可在细菌之间转移抗生素抗性基因或毒力基因，噬菌体耐受也是一大问题，而游离的解聚酶在遗传上相对稳定，同时产生抗性的几率也较完整噬菌体产生抗性的几率低。
2.2 解聚酶降解生物膜的能力
EPS（胞外多糖）主要负责生物膜结构和功能的完整性，并影响其毒力。Gutiérrez等人曾将vB_SepiS-phiIPLA7的解聚酶Dpo7用于对抗葡萄球菌形成的生物膜，结果显示，与对照组相比，Dpo7将表皮葡萄球菌ASLD1的EPS基质降低到31%，而表皮葡萄球菌LO5081的EPS基质降到75%。同时，提前用Dpo7处理聚苯乙烯表面，会使测试菌株形成的生物膜含量或活性降低。EPS解聚酶Dpo7能抑制生物膜的形成，也能分散不同葡萄球菌菌株产生的生物膜。肺炎克雷白噬菌体SH-KP152226编码的解聚酶Dpo42可裂解肺炎克雷白k47型荚膜，与对照组相比，10μg/mL的Dpo42处理便可减少生物膜中的细菌。同时，Dpo42还可降解肺炎克雷白2226菌株形成的EPS。铜绿假单胞噬菌体IME180编码的解聚酶不仅能抑制宿主菌形成生物膜，还能减少预先形成的生物膜的生物量。
2.3 解聚酶联合其它制剂降解生物膜
俗话说“好手不敌双拳，双拳不如四手”。尽管解聚酶对生物膜能起到很好的降解效果，但联合能使其的功能锦上添花。表1例举了解聚酶联合噬菌体、抗生素、消毒剂、化合物对生物膜的研究。
表1 联合处理生物膜形成的研究（引自文献1）
酶名称 | 联合物 | 生物膜类别 | 结果（与单独处理组比较） |
KPO1K2编码的解聚酶 | 环丙沙星 | 肺炎克雷伯菌B5055 | 根除生物膜 |
KPO1K2编码的解聚酶 | 庆大霉素 | 肺炎克雷伯菌B5055 | 减少早期生物膜的细菌量 |
解聚酶Dpe42 | 多粘菌素 | 肺炎克雷伯菌2226 | 减少细菌数量 |
解聚酶KP34p57 | 环丙沙星 | 肺炎克雷伯菌77 | 减少菌落数量 |
解聚酶KP34p57 | 环丙沙星+φkp15(不编码解聚酶) | 肺炎克雷伯菌77 | 减少菌落数量 |
φEnt编码的解聚酶 | 消毒剂 | 团聚肠杆菌菌株Ent | 更有效减少生物膜 |
KPO1K2编码的解聚酶 | 硫酸钴 | 肺炎克雷伯菌B5055 | 减少细菌数量 |
KPO1K2编码的解聚酶 | 木糖醇 | 肺炎克雷伯菌B5055，铜绿假单胞菌PAO | 更有效减少生物膜 |
噬菌体EC3a | 蜂蜜 | 大肠杆菌CECT434 | 更有效的抗生物膜活性
|
3 结语
尽管解聚酶单独或联合其他制剂对生物膜的清除有很好的作用，但作为噬菌体的衍生物，想要获得纯净的噬菌体酶类过程繁琐，成本也较单纯使用噬菌体高。因此，将噬菌体酶类用于临床治疗还有很长一段路要走，虽然前途光明，却也任重道远。
参考文献
1. Topka-Bielecka G, Dydecka A,Necel A, et al. Bacteriophage-Derived Depolymerases against Bacterial Biofilm. Antibiotics(Basel). 2021 Feb 10;10(2):175. doi: 10.3390/antibiotics10020175.
2. Roach DR, Donovan DM.Antimicrobial bacteriophage-derived proteins and therapeutic applications.Bacteriophage. 2015 Jun 23;5(3):e1062590. doi:10.1080/21597081.2015.1062590.
注：本文原载于“上海噬菌体与耐药研究所”微信公众号，作者：杨斓
地址：华宁路3333弄14号楼
电话：400-668-7738（总机）
创噬纪（上海）生物技术有限公司 版权所有 沪ICP备2022031782号-1 网站设计:JCE
