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噬菌体多样性及其在生物技术中的应用概述
日期：2023-02-21
现代分子生物学技术的许多内容来源于研究人员对λ噬菌体的了解，λ噬菌体是长尾噬菌体科的一员。T7噬菌体是短尾噬菌体科的一员（图A），彻底革新DNA测序的“测序酶”是T7噬菌体DNA聚合酶的一种稍加修饰的形式，而T7噬菌体RNA聚合酶系统已被证明是异源蛋白表达的主要工具，能使体外转录系统的一些应用成为可能。
Microviridae科的phiX174噬菌体（图A），是Fred Sanger 测序的第一个基因组；Arthur Kornberg使用其作为模型系统用来证明使用纯化酶在体外合成DNA会产生一种生物活性物质；Craig Venter的实验表明，由合成寡核苷酸创建的基因组对于产生生物活性物质是必要和充分的。
Leviviridae科的MS2噬菌体（图A），是一种仅编码四种蛋白质的极简病毒，可感染大肠杆菌。MS2 外壳蛋白与源自 MS2 操纵基因序列的发夹序列相结合，共同构成了真核细胞中特定RNA活细胞成像革命性系统的基础。
在革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的基因组中检测到四种长尾噬菌体科前噬菌体：φNM1—4，引起了基于原噬菌体有效荷载递送的研究：来自φNM1噬菌体中的一小部分基因被用于制造包装衣壳，以传递针对金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9系统，且这种噬菌体疗法已被用于杀死耐抗生素金黄色葡萄球菌1型的MRSA病毒。
丝状噬菌体科包括具有不同结构和生活方式的噬菌体亚科（图 A）。丝状噬菌体列于这些亚群之一，包括一些比其感染的细菌基因组更长的物种，其长度从 800 nm 到4 μm不等（图B）。
（B）大肠杆菌 Ff 噬菌体示意图（包括结构蛋白的整体结构及拷贝数）
我们对丝状噬菌体生物学的理解多源于一类密切相关的大肠杆菌噬菌体，称为 Ff 丝状噬菌体。丝状噬菌体M13、fd 和 f1，它们具有98%的DNA序列同源性，且复制机制相同。这些丝状噬菌体是在20世纪60年代早期的污水样本中独立发现的，在此将它们统称为大肠杆菌 Ff 噬菌体。Ff 噬菌体（和大多数丝状噬菌体）的一个共同特征是它们不裂解宿主。的确，当其切离染色体时它们不会在细菌培养皿中形成噬菌斑，而是形成不透明的生长抑制区。我们对丝状噬菌体生物学的了解大部分来自对这些Ff噬菌体的研究，但丝状噬菌体科中体现的丰富的多样性并不能被 Ff 噬菌体代表。
Ff 丝状噬菌体产生了用于DNA测序的早期克隆载体之一—M13噬菌体，Ff 是噬菌体展示蛋白质-蛋白质相互作用筛选和蛋白质、肽、抗原或抗体库成熟的基础。Ff 被用于噬菌体展示技术的几个特点：（i）这些病毒颗粒的组装不会裂解大肠杆菌宿主，允许噬菌体颗粒在整个培养过程中释放，达到噬菌体的最高滴度（每毫升培养物高达 1013 个病毒颗粒）； (ii) 衣壳蛋白易于与其他蛋白进行基因融合，从而在病毒颗粒表面展示外源蛋白； (iii) Ff 基因组小且易于修改，最重要的是，修改后的基因组被包装成病毒颗粒，展示相应的修改后的衣壳蛋白。蛋白质和相应 DNA 之间的这种物理联系允许从文库中分离所需的蛋白质/肽/抗原/抗体以及编码该特定变体的基因，并通过顺序筛选提高相互作用的亲和力（图C）。
C.噬菌体展示技术
在噬菌体展示筛选中，将天然或合成 DNA 文库克隆在信号肽和成熟 pIII 编码基因之间的噬菌体载体上，该载体包含 Ff 复制起点、质粒复制起点和选择标记。噬菌体载体被转化到大肠杆菌中，该大肠杆菌感染了含有Ff 来源的辅助噬菌体载体。辅助噬菌体载体产生噬菌体复制和组装所需的所有元件，噬菌体载体产生修饰的 pIII 衣壳。噬菌体与含有插入片段的 pIII 衣壳蛋白亚群组装和分泌。噬菌体文库经过多轮“淘选”：(i) 噬菌体被应用到具有固定配体或靶标的基质上，那些展示结合靶标/配体或被靶标/配体识别的肽的噬菌体被结合，而非结合噬菌体被洗掉，然后，（ii）结合的噬菌体被洗脱并用于感染大肠杆菌细胞，然后合并并用辅助噬菌体感染以扩增文库并产生噬菌体用于随后的淘选。多次淘选循环可以产生亲和力增加的肽。
2018年与酶的定向进化同时被授予诺贝尔化学奖的研究中就包括了Sir Gregory Winter 和George Smith在新型蛋白质的定向进化中噬菌体展示的研究，特别是针对基于肽类和抗体的噬菌体展示技术的研究。
原文：Hay ID, Lithgow T. Filamentous phages: masters of a microbial sharing economy. EMBO Rep. 2019 Jun;20(6):e47427.
doi: 10.15252/embr.201847427. Epub 2019 Apr 5.
注：本文原载于“上海噬菌体与耐药研究所”微信公众号，作者：王晓，李若愚
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