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噬菌体在蔬菜瓜果中的应用
日期：2023-02-21
1噬菌体：重新拾起的抗菌武器
食源性细菌可通过新鲜农产品传播，危害着世界上几乎每个国家的食品安全。它们参与了新鲜农产品链中的每一个环节，包括采摘现场、包装车间及在厨房的最终加工过程，在全世界引起了越来越多的食源性疾病暴发。如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、志贺氏菌和单增李斯特菌等病原体的感染可引起腹泻，甚至是包括肾衰竭和其他危及生命的疾病。抗生素处理和化学消毒是阻止食品中细菌污染的有效方法。然而，抗生素和化学消毒剂的大量使用导致了耐抗生素和耐消毒细菌的出现和传播。因此，开发替代策略以有效减少细菌病原体对新鲜农产品的污染是当务之急。在全球限抗禁抗和减少化学消毒剂使用的大环境下，噬菌体作为有效的食品安全预防措施走进了人们的视野。噬菌体是地球上最丰富的生物实体，广泛的细菌宿主使它们成为阻止致命细菌感染传播的有力工具。噬菌体在所有环境中无处不在，包括土壤、水、惰性和活性表面、新鲜和加工食品，甚至存在于动物和人类的肠道中，但对人类和动物的生命健康没有风险。事实上，有关提高食品安全的研究和最近对商业噬菌体产品的几项监管批准强调，噬菌体为显著减少各种食品上的食源性细菌污染提供了一种安全、环保和有效的方法。目前，用于食源性细菌病原体生物防治的噬菌体主要属于肌尾病毒科和长尾病毒科，在食品中用作生物防治剂的噬菌体应具有一些额外的属性。例如，它们必须是裂解性噬菌体，不应携带毒力或溶原性基因，不含过敏触发蛋白，且能在非致病性菌株中快速大量繁殖。此外，最好能够抵抗预期使用时的环境条件。因此，必须对噬菌体进行详细表征，以提供有用的信息来确定它们作为生物防治剂的潜力。用于食品和食品生产链环境中的市售噬菌体产品已经过实验检验。Bhardwaj等人描述了可利用噬菌体控制食源性细菌病原体的三类环境：(1) 食品原料的收获前控制；(2) 食品加工设备中无生命表面的去污；(3) 将噬菌体直接应用于收获/加工后食品。从食品加工生产的进程上来看，应用于水果和蔬菜环境的噬菌体产品可能是类似的，特别是后两种环境可以用噬菌体制剂进行处理以保障食品安全[2]。
2与蔬菜瓜果有关的食源性疾病
食源性疾病位居全球发病率和死亡率前五名（CDC 2010）。研究已发现约250种食源性疾病，美国每年报告约940万例食源性疾病，其中约有56000人住院，1300人死亡。大多数病例都是由公认的食源性病原体引起的，包括弯曲杆菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、志贺氏菌和其他肠道微生物（如甲型肝炎病毒、环孢子菌和隐孢子虫等）。这些案例的发生除与外源因素（如温度储存不足、员工卫生差、设备受到微生物污染或食用不安全来源的食物等）有关外，大多数案例归因于新鲜农产品本身[3]。表1描述了一些归因于新鲜农产品的食源性疾病案例。
表1 近年来涉及新鲜农产品暴发的食源性细菌病原体的精选报告
（摘自 López-Cuevas O等，2021）
3噬菌体清除蔬菜瓜果上细菌的应用
3.1噬菌体清除蔬菜瓜果上沙门氏菌的应用
近几年蔬菜和水果中沙门氏菌暴发的案例较多（表 1），一些研究小组正在寻找消毒替代品，包括许多噬菌体制剂。其中，Intralytx开发的商业噬菌体制剂 SalmoFresh TM由六株靶向沙门氏菌的噬菌体组成“鸡尾酒”，并已被FDA认证为GRAS（一般认为安全），还获得了加拿大卫生部和以色列卫生部的批准。自此噬菌体“鸡尾酒”批准以来，许多应用于食品的噬菌体产品正进行试验评估。Spricigo等人发现由三株噬菌体（UAB_Phi20、UAB_Phi78和UAB_Phi87）组成的“鸡尾酒”在室温下应用60分钟后，可显著减少鲜切生菜中肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的数量[4]。Huang等发现储存于24°C的生菜被肠炎沙门氏菌ATCC 13076污染后，将噬菌体LPSE1在感染复数（MOI）为1、10和100应用时沙门氏菌分别减少了2.02 Log10、1.71 Log10和1.45 Log10 CFU/mL。表明噬菌体可以有效减少蔬菜中沙门氏菌的数量，且噬菌体的有效性与MOI相关。
3.2噬菌体清除蔬菜瓜果上大肠杆菌O157:H7的应用
诸多报道表明噬菌体在作为化学消毒替代品上有巨大潜力。Abuladze等发现名为EcoShield TM的噬菌体制剂可使10°C存放1、5、7天的西兰花样品中的大肠杆菌O157:H7数量分别减少99.5%、99%和97%。Sharma等进一步证实EcoShield TM可使受污染的鲜切卷心菜和哈密瓜上存活的大肠杆菌O157:H7数量分别减少10^2 CFU/cm^2、10^2-10^3 CFU/mL。Carter等用大肠杆菌O157:H7试验性污染长叶莴苣，并于4°C下存放5天，后将噬菌体EcoShield TM喷洒在莴苣上，5分钟后高达87%的大肠杆菌被消灭。Viazis等用四株大肠杆菌O157:H7混合物试验性污染生菜和菠菜后，噬菌体 “鸡尾酒”BEC8与反式肉桂醛 (TC，一种具有杀菌消毒防腐作用的化合物) 联合使用时对大肠杆菌的杀菌效果优于单独使用BEC8或TC[5]。这些报道表明了噬菌体作为蔬菜瓜果消毒品杀灭大肠杆菌的有效性和巨大的应用潜力.
3.3噬菌体清除蔬菜瓜果上单增李斯特菌的应用
2006年，FDA和USDA首次批准使用噬菌体制剂ListexTM P100用于控制即食食品中的单增李斯特菌，并将其认证为GRAS。Oliveira等人通过实验评估了食物的pH值和物理形态对噬菌体ListexTM P100效果的影响。结果显示，在高pH值食物甜瓜（切片或果汁）中噬菌体的有效性均高于梨，而在低pH食物苹果中几乎检测不到噬菌体，预示着pH值对噬菌体活性的影响。同时，甜瓜汁和梨汁中的李斯特菌明显减少（分别降低8.00 Log CFU/mL和2.10 Log CFU/mL）。表明噬菌体ListexTM P100可有效抑制单增李斯特菌在高pH值食品（甜瓜、梨）切片或果汁中的生长；然而，对于低pH值食品（苹果），可能需要结合其他技术来提高噬菌体的活性和有效性[6]。
总结与展望
人们对噬菌体未来作为生物防治剂的兴趣日益浓厚，因此应在新鲜农产品行业考虑更好的应用策略。然而，生鲜产业中噬菌体的应用仍面临诸多挑战，包括有效性问题、噬菌体配方（单独或混合使用）、噬菌体保存（液体、粉末状等）以及规模化生产中噬菌体扩增和纯化方法的优化。但是，噬菌体的应用仍然是一件令人兴奋的事情，它将为新鲜农产品行业的食品安全带来许多好处，包括可能改变耐药性细菌日益流行的现状。基于生物技术和分子生物学领域的快速发展，希望噬菌体能很快被纳入现代控制食源性细菌的方法武器库。
参考文献
1. López-Cuevas O, Medrano-Félix JA, Castro-Del Campo N, Chaidez C. 2021. Bacteriophage applications for fresh produce food safety. Int J Environ Health Res. 31(6):687-702.
2. Bhardwaj N, Bhardwaj SK, Deep A, Dahiya S, Kapoor S. 2015. Lytic bacteriophages as biocontrol agents of foodborne pathogens. Asian J Anim Vet Adv. 10(11):708-723.
3. Denis N, Zhang H, Leroux A, Trudel R, Bietlot H. 2016. Prevalence and trends of bacterial contamination in fresh fruits and vegetables sold at retail in Canada. Food Control. 67:225-234.
4. Spircigo DA, Bardina C, Cortés P, Llagostera M. 2013. Use of a bacteriophage cocktail to control Salmonella in food and the food industry. Int J Food Microbiol. 165:169-174.
5. Viazis S, Akhtar M, Feirtag J, Diez-Gonzalez F. 2011. Reduction of Escherichia coli O157: H7 viability on leafy green vegetables by treatment with a bacteriophage mixture and trans-cinnamaldehyde. Food Microbiol. 28(1):149-157.
6. Oliveira M, Viñas I, Colàs P, Anguera M, Usall J, Abadias M. 2014. Effectiveness of a bacteriophage in reducing Listeria monocytogenes on fresh-cut fruits and fruit juices. Food Microbiol. 38:137-142.
注：本文原载于“上海噬菌体与耐药研究所”微信公众号，作者：李洁
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