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向结核进军——Graham Hatfull和他的噬菌体王国
日期：2023-02-21
1. 王朝的建立：谁不想发现一个新病毒呢？
分枝杆菌是一类古老且难以对付的致病菌，包括导致结核病的结核分枝杆菌、引起麻风病的麻风分支杆菌和脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌等非结核分枝杆菌。由于细胞内寄生、广泛耐药等特点，分枝杆菌引起的疾病非常难治。Graham Hatfull教授1988年起任职于匹兹堡大学生物科学系，主要工作就是跟分枝杆菌和它们的噬菌体打交道。噬菌体是一类感染细菌的病毒，在电子显微镜下，它们就像一个个纳米机器人。Hatfull工作后的第一个课题是对分枝杆菌噬菌体L5进行基因组测序，这个工作在当时足足花了5年时间。那时的Graham可能不敢想象，如今他主导的SEA-PHAGES（Science Education Alliance–Phage Hunters Advancing Genomic and Evolutionary Science）项目每年就要测序数百株噬菌体。
在2020年度Peter Wildy奖（英国微生物学会每年奖励一位对微生物科学教育与传播有突出贡献的人物）获奖致辞中，Hatfull的标题是：谁不想发现一个新病毒呢[1]？的确，从自然界中分离细菌的病毒——噬菌体，可能是实现这一目标的最安全、最便捷的办法。带着这个目标，每年有数百名来自全球各地的本科生参与到SEA-PHAGES项目，从不同地域、不同环境的样本中分离分枝杆菌的噬菌体，进行测序、表征、命名并加入不断壮大的噬菌体库中。如今，Hatfull团队的分枝杆菌噬菌体库已达到近2万株规模、其中4000多株已经测序。
2.一鸣惊人：首个基因编辑噬菌体治疗案例
2017年圣诞节前夕，15岁的小姑娘Isabelle从英国伦敦大奥蒙德街儿童医院 (Great Ormond Street Hospital for Children）无奈出院，双肺移植虽然让她摆脱了囊性纤维化的折磨，但移植后的脓肿分枝杆菌感染已击败了所有的治疗手段，她不得不返回家中姑息治疗。但是， Isabelle的母亲并不愿意放弃，她了解到噬菌体治疗可能是仅存的办法，在她的坚持下，Helen Spencer医生通过同事向Graham Hatfull发起求助。
噬菌体感染细菌后大量增殖，最后裂解细菌释放子代噬菌体再去重复这一过程，这听起来就是治疗细菌感染的绝佳方法。事实上，100多年前，噬菌体的发现者Félix d'Herelle就开创了噬菌体疗法。但是，Hatfull非常清楚他面临的难题：裂解性噬菌体相当“挑食”，还有一大部分的噬菌体是整合到细菌的基因组中而通常不走裂解路线的温和噬菌体。而在Hatfull的噬菌体库中，绝大多数噬菌体都是通过相对生长快、不致病的耻垢分枝杆菌作为宿主来筛选的，能否跨种裂解脓肿分枝杆菌还是个未知数。
幸运的是，Hatfull的噬菌体库中有3株噬菌体Muddy、BPs和ZoeJ能够裂解Isabelle的脓肿分枝杆菌。但是只有Muddy是裂解性噬菌体，另两株都是温和噬菌体，单独使用Muddy很可能会诱导细菌对噬菌体的耐受。此时，留给Isabelle的时间已经不多了，与她同时期申请的另一位小病友没等到噬菌体治疗便不幸去世。Hatfull不得不做出决定，通过基因编辑将BPs和ZoeJ转变为裂解性噬菌体。虽然这一技术在实验室司空见惯，但此前从未有基因编辑噬菌体在人体内的应用。
最终，Muddy、基因编辑后的BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45组成了噬菌体鸡尾酒，每一剂都含有10亿个裂解性噬菌体，由Hatfull团队的研究人员Rebekah Dedrick亲自带往伦敦。Isabelle接受了通过皮肤湿敷和静脉注射的噬菌体治疗，从第9天开始在家继续每天2次的静脉注射噬菌体治疗。随着治疗的进行，Isabelle的肺部和血液中的脓肿分枝杆菌消失了，虽然皮肤结节拭子偶尔还能培养出，但她的移植刀口和皮肤感染灶明显好转，体重增加，感染灶炎症区域较治疗前明显缩小，肺功能和肝功能指标明显改善。1年后，虽然Isabelle仍然需要坚持每天注射噬菌体，她在很多方面已恢复到正常生活了。而在整个治疗过程中，除了刚开始噬菌体治疗时出现过出汗和潮红，并没有其他的不良反应。
2019年5月，联合治疗团队将这一案例发表在Nature Medicine上[2]，立即引起轰动。可以想象，开展第一例基因编辑噬菌体治疗的突破性多大，背后团队曾经承受的压力就有多大。幸运的是，Hatfull团队成功了，三株教育项目筛选到的噬菌体经过实验室改良后挽救了Isabelle的生命。而后更多的案例也就顺理成章了。
3.有苦有甜，在经验和教训中发展
2021年7月，Hatfull团队再次在Nature Medicine发文[3]，报道与约翰霍普金斯大学医学院Keira Cohen医生合作的噬菌体治疗案例。一位81岁支气管扩张患者肺部感染脓肿分枝杆菌，也能被Muddy、BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45裂解。于是，患者接受了与Isabelle同样方案的静脉注射噬菌体治疗。在噬菌体治疗的6个月内患者未出现不良反应，但感染指标和临床症状也没有任何改善。虽然在治疗后第1个月患者痰内的脓肿分枝杆菌载量降低了十倍，但是从第2个月开始又迅速增多，甚至超过了治疗前水平。对治疗后检出的脓肿分枝杆菌分析发现它们的抗生素耐药格局没有变化，只对噬菌体ZoeJΔ45的敏感性稍有减弱，对Muddy和BPs33ΔHTH-HRM10的敏感性依旧，说明噬菌体耐受并非这次治疗失败的主因。进一步检查发现，治疗失败的原因可能在于患者在噬菌体治疗后血液中持续产生大量的针对三株治疗噬菌体的中和抗体。而在Isabelle的噬菌体治疗过程中，至少监测了9个月都未发现针对这三株噬菌体的中和抗体。这也提示，Isabelle的免疫抑制状态（肺移植后免疫抑制剂服用）可能还有利于噬菌体的存活和治疗的成功。
2022年5月3日，Hatfull团队与哈佛大学医学院Jessica Little医生的合作取得突破，他们第一次把噬菌体治疗拓展到龟分枝杆菌感染[4]。发表在Nature Communications上的论文显示，一位血清阴性关节炎患者长期接受免疫抑制治疗，左臂不幸感染一株耐药龟分枝杆菌，近半年的抗生素治疗并未奏效，还引起了多种药物毒性反应。在求助噬菌体治疗后，Muddy再次立功，虽然是仅有的一株能够裂解该患者龟分枝杆菌的噬菌体，但Muddy的裂解效果非常好且体外实验显示不易诱导耐受。于是，患者开始接受每天2次静脉注射Muddy治疗，期间抗生素治疗也并未中断，还进行了一次针对最大脓包的手术切除。在噬菌体治疗两周后便能观察到皮损炎症和结节明显减少，并在随后的几个月里持续改善，皮肤和皮下软组织病变均有减轻，多次龟分枝杆菌培养阴性。对治疗后第3天、第17天和第16周的血清中检测到针对Muddy的中和抗体，不过总体上并未改变噬菌体治疗的结局。对分枝杆菌来说，只用一株Muddy治疗很可能是徒劳无功的，但当时并没有其他的选择。好在这个案例确实有足够的运气，并未发生治疗前担忧的细菌耐受噬菌体，关键是治疗成功了。
10天后，顶尖杂志Cell发表了其第一篇噬菌体治疗案例论文[5]，Hatfull团队这篇论文的亮点在于：在500多天的超长噬菌体治疗周期内，通过全面的分子生物学、代谢分析和影像学评估，明确地证明了噬菌体在人体内的杀菌效果。特别是除了直接的细菌培养指标，还通过细菌核酸定量诊断，尿液中分枝杆菌特有的细胞壁标志物和血液中脓肿分枝杆菌特异抗体水平间接印证了噬菌体的体内杀菌效果。通过持续追踪噬菌体治疗前后患者肺部分离的40余株脓肿分枝杆菌并进行基因测序和进化分析，发现噬菌体治疗显著降低了病原菌的菌株多样性。这解答了以往绝大多数案例研究难以回答的问题（患者的康复是噬菌体治疗的功劳吗？）。在噬菌体治疗之前，三家移植中心曾因分枝杆菌感染而拒绝Jarrod Johnson的肺移植请求，对他来说无异于死刑判决。美国国家犹太健康中心囊性纤维化专家Jerry Nick医生接受了Jarrod并求助了Hatfull团队，在2株噬菌体BPs33ΔHTH-HRM10和D29_HRMGD40治疗后，随着Jarrod脓肿分枝杆菌感染的控制，他进入了等待肺移植的名单。在噬菌体治疗第379天，26岁的Jarrod终于迎来了肺移植，整个移植前后噬菌体治疗都未间断。最终，Jarrod摆脱了针对脓肿分枝杆菌的抗生素治疗。Jarrod的遭遇并非个例，许多囊性纤维化患者由于感染分枝杆菌而丧失器官移植的资格，噬菌体治疗有望为他们扫清障碍，获得接受器官移植的机会。
4. 离噬菌体治疗结核病还有多远
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核分枝杆菌可以侵犯人体任何部位，其中肺结核占各种类型结核病的80%以上，是迄今为止导致死亡人数最多的传染病。尽管近年来发病率缓慢下降，但离战胜结核病还很远。结核分枝杆菌由于其高度保守的基因组和相对缺乏的天然噬菌体防御机制，似乎很适合噬菌体治疗，大量的体外研究也表明了噬菌体治疗结核分枝杆菌的潜力。但结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，其细胞屏障是无论抗生素还是噬菌体治疗均需面临的难题，结核容易发生的肉芽肿环境更加大了药物渗透难度。此外，由于结核分支杆菌生长极其缓慢，目前临床采用的个性化噬菌体筛选很难实行。但在另一方面，由于胞内寄生的结核分枝杆菌无需通过大量突变逃避宿主免疫，它们的遗传多样性相对低，目前仅发现9类结核分枝杆菌谱系。这种有限的菌株变异无疑给组装噬菌体广谱鸡尾酒提供了发挥空间。Hatfull团队将包含Muddy和D29在内的5株噬菌体组合成鸡尾酒，在体外对所有主要谱系的结核分枝杆菌菌株都显示了杀伤活性[6]。
如今，无论在世界各地，提到分枝杆菌的噬菌体治疗，大家第一个想到的多半是找Graham Hatfull筛选噬菌体。除了拥有大量的噬菌体，Hatfull团队还获得了大量的临床分枝杆菌菌株，包括来自270多位求助噬菌体治疗患者的分枝杆菌，这些细菌和噬菌体是绝佳资源。当前，分枝杆菌噬菌体绝大多数是用一株耻垢分枝杆菌模式株分离的，噬菌体特异性降低了它们同时裂解其他种类分枝杆菌的几率，这也是为何Hatfull庞大的噬菌体库中只有几株噬菌体能够裂解上述临床菌。因此，Hatfull团队目前尤其关注这些菌株基因组中隐藏的噬菌体痕迹。整合到靶细菌基因组中的完整噬菌体序列是其能感染该细菌的证据，通过分子生物学将其激活、释放和改造成裂解性噬菌体将能突破耻垢噬菌体的特异性局限，将是筛选治疗用噬菌体的又一策略。显然，噬菌体基因组学研究、SEA-PHAGES资源积累和临床治疗研究组成了Hatfull噬菌体王国的三个王牌军，离治疗结核病更近了一步。
5. 谁不想自己发现的新病毒能救人一命呢？
上述4个案例中使用了4株噬菌体，分别是D29、Muddy、BPs和ZoeJ。其中D29和Muddy是裂解性噬菌体，BPs和ZoeJ是温和噬菌体（经基因编辑后用于治疗）。它们最初都是使用耻垢分枝杆菌模式株mc2155作为宿主菌分离的。D29于1954年由加州大学洛杉矶分校的S. Froman发现，D29还能裂解结核分枝杆菌，也被用于结核菌诊断。除了D29，另外3株噬菌体都与SEA-PHAGES项目相关。噬菌体BPs是匹兹堡大学本科生Tim Sampson在2006年从一处排水沟里分离的，名字是纪念他高中时组建的地下室剧团Basement Productions。Muddy是南非KwaZulu-Natal大学的本科生Lilli Holst在2010年发现的，命名为“烂泥”很好的交代了它分离自一处堆肥箱的烂茄子样本。不过Muddy已成为明星噬菌体，Hatfull团队超过一半的治疗案例（含未发表案例）中都有它的身影。ZoeJ是2012年普罗维登斯学院（Providence College）学生Seth Pinches从土壤中发现的，与Seth的小侄女Zoe Jean同名。
发现噬菌体是一个快乐的过程，自己发现的噬菌体在关键时刻能够救人一命会带来更大的成就感。在中国，你也有机会成为一名 “噬菌体猎手”。2019年底，上海噬菌体与耐药研究所与上海师范大学第二附属中学合作发起“噬菌体猎手”兴趣营（PHD）项目，虽因新型冠状病毒肺炎疫情而推迟，相信在不久的将来将再度开启。分枝杆菌只是噬菌体治疗对象中的冰山一角，鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等临床常见致病菌带来的威胁已逐渐赶超结核分枝杆菌，噬菌体在这些病原体上的临床应用更加普遍。期待未来，也有一路中国王牌军，向更广阔的耐药细菌疾病宣战。
参考文献
[1] Hatfull. Wildy Prize Lecture, 2020–2021: Who wouldn’t want to discover a new virus? Microbiology, 2021;167:001094.
[2] Dedrick et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 2019 May;25(5):730-733.
[3] Dedrick et al. Potent antibody-mediated neutralization limits bacteriophage treatment of a pulmonary Mycobacterium abscessus infection. Nat Med. 2021 Aug;27(8):1357-1361.
[4] Little et al. Bacteriophage treatment of disseminated cutaneous Mycobacterium chelonae infection. Nat Commun. 2022 May 3;13(1):2313.
[5] Dedrick et al. Host and pathogen response to bacteriophage engineered against Mycobacterium abscessus lung infection. Cell. 2022 May 10:S0092-8674(22)00471-8.
[6] Guerrero-Bustamante et al. Toward a Phage Cocktail for Tuberculosis: Susceptibility and Tuberculocidal Action of Mycobacteriophages against Diverse Mycobacterium tuberculosis Strains. mBio. 2021 May 20;12(3):e00973-21.
注：本文原载于“上海噬菌体与耐药研究所”微信公众号，作者：吴楠楠。
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