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肺部感染如何进行噬菌体治疗？
日期：2023-02-21
呼吸道感染严重威胁人类健康，一系列肺部感染（如细菌性肺炎、囊性纤维化相关的细菌感染、结核病等）因为抗生素耐药性问题难以治疗、甚至威胁生命安全。在耐药问题日益严重的趋势下，噬菌体疗法代表了一种安全、有效的抗菌策略。如何将噬菌体高效地递送至感染部位、以杀灭病原菌，一直是噬菌体疗法探讨的问题之一。本文就肺部感染噬菌体治疗，对吸入噬菌体方法（雾化、干粉吸入）进行简要讨论。
1、雾化吸入
雾化是通过特殊喷嘴将液体转化为细雾的过程，它是通过肺部途径递送药物的首选，这是基于制剂的液体性。为了通过雾化递送药物，药物必须首先分散在液体（通常是水）介质中。在施加分散力（气体射流或超声波）后，药物颗粒被包裹在气溶胶液滴中，随后可被吸入至肺部。
有许多类型的雾化方法，它们使用不同的机制来产生气溶胶液滴。（1）空气压缩式雾化器，也叫射流式雾化，基于文丘里(Venturi Principle)喷射原理，利用压缩空气穿过细小管口，高速气流产生的负压带动液体喷射到挡板上，液体被雾化成微米大小的液滴喷出，而较大的液滴被挡板捕获、重新雾化。（2）在晶体管式超声雾化中，液滴的产生是通过压电晶体的高频振动，这些振动被传递到换能器上，通过网板推动液体悬浮物向上和向下挤压而产生气溶胶液滴，或者通过晶体直接振动网板。（3）电子管式超声波雾化器也基于逆压电效应原理，由压电晶体振动产生高频声能波（这里不需要网板），通过缓冲介质传递到液体中，由于液体中空化气泡的坍塌，从而产生气溶胶液滴。超声波雾化器产生气溶胶颗粒尺寸比喷射雾化器更均匀， 晶体管式超声雾化器和电子管式超声雾化器在医院中也更为常见。
图1 射流式雾化器（A）和超声波雾化器（B）的示意图
图片来源：Ultrasonic nebulization platforms for pulmonary drug delivery
已有许多研究报道了使用不同类型雾化器对于噬菌体的雾化效果。然而，雾化器在雾化噬菌体的过程中，压缩空气高速射流产生的机械应力、高频声能产生的热应力、再雾化和冲击过程中的剪切应力，可能使噬菌体尾部丢失、核酸排出，对噬菌体结构完整性具有潜在的破坏作用，导致噬菌体生存力和感染能力降低。Turgeon等人报道了在雾化器雾化噬菌体后，气溶胶液滴中噬菌体基因组拷贝比实际PFU高1000多倍，说明噬菌体滴度降低，表明雾化过程破坏了噬菌体结构。在另一项研究中，感染铜绿假单胞菌的肌尾噬菌体PEV44经过上述三种雾化器雾化后，“破碎“的噬菌体比例显著增加，其中空气压缩式雾化器是83%，超声雾化器为50-60%。Leung等人用透射显微镜观察了不同形态的噬菌体对空气压缩式雾化器的敏感性，结果表明噬菌体“破碎”与噬菌体尾长密切相关。空气压缩式雾化器对噬菌体PEV2（非收缩性尾巴，短、粗）基本无影响；噬菌体PEV40（收缩性尾巴，长、直）和D29（非收缩性尾巴，长）经过雾化后，完整噬菌体颗粒的比例分别下降至27~50%、2~15%。这说明，与短尾噬菌体相比，长尾噬菌体对喷射雾化过程中的压力更敏感，并且对于这些长尾噬菌体，尾巴脱落是最常见的损伤类型。
图2. 三类有尾噬菌体的结构示意图（a. 长尾噬菌体 b. 肌尾噬菌体 c. 短尾噬菌体）
图片来源：The "fighting wisdom and bravery" of tailed phage and host in the process of adsorption
其他因素如相对湿度和温度也可能影响雾化效果。Liu等人评估了三种不同雾化溶剂（去离子水、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和生理盐水）对于雾化噬菌体D29的影响。结果表明，当雾化溶剂是去离子水时，产生的D29气溶胶液滴明显多于PBS或生理盐水。由去离子水产生的气溶胶液滴中的噬菌体保持了更好的活力（PFU比PBS或生理盐水高30-300倍），暗示高盐浓度和高离子对生物气溶胶的稳定性起负向作用。另外，用去离子水产生的气溶胶液滴直径处于中值质量空气动力学直径（2.4 μm），更易到达和沉积在更深的肺细支气管中。
2、干粉吸入
尽管雾化吸入是噬菌体肺部递送的优选方案，但固体噬菌体制剂仍需要进行干粉吸入。噬菌体由外壳蛋白和核酸组成，蛋白在干燥状态下比在溶液形式下表现出更好的稳定性，因此干粉噬菌体有更长的有效期，且方便运输、易于储存。不同于雾化器在雾化过程中产生物理应力、损伤噬菌体，干粉吸入靠人主动呼吸、在吸入过程中噬菌体不会产生损耗。
图3 常见的干粉吸入器
图片来源：Asthma Medications and Devices: Drug Delivery Devices
生产干粉噬菌体的方法主要有三种，包括喷雾干燥、冷冻干燥和喷雾冷冻干燥。喷雾干燥是将液体雾化后喷射到热干燥气体中，水分蒸发后形成干燥颗粒。干燥颗粒反复暴露在热气流中，会对热敏噬菌体产生直接的破坏作用，因此传统喷雾干燥技术并不适用制备干粉噬菌体。研究人员使用改良后的低温喷雾干燥工艺生产了噬菌体KS4‐ M、KS14以及KZ/D3和KZ/D3/KS4‐M混合噬菌体的干粉可吸入制剂。在配方中，海藻糖用于防止噬菌体脱水，而亮氨酸的加入有助于提高粉末的分散性。通过确定它们的中值质量空气动力学直径（median mass aerodynamic diameter ，MMAD）来测量所得干粉的气溶胶性能。MMAD代表空气动力学直径，空气动力学直径在0.5到5 μm之间的颗粒更易到达和沉积在细支气管中，直径大于5 μm的气溶胶颗粒倾向于沉积在咽喉中，而不能到达肺部。在这项研究中，低温喷雾干燥工艺生产的噬菌体粉末MMAD直径为2.5-2.8 μm，能使噬菌体递送到肺部。
冷冻干燥技术使用低温脱水方法，首先将溶剂冷冻成冰，然后通过真空低压使水分升华，形成干燥粉末。冻干过程中噬菌体滴度的损失无法避免，且直接生产出来的冻干粉末需要使用额外的研磨步骤将颗粒直径减小至5 μm以下，以达到肺部给药的要求，但研磨产生的机械应力会进一步损耗噬菌体。Golshahi等人制备了无内毒素的噬菌体KS4-M和KZ冻干粉末，以60%乳糖和40%乳铁蛋白作为选定的低温保护剂和稳定剂，然后在混合粉碎机中去凝聚、降低粉末颗粒直径，形成可吸入性粉末。冻干后，两种噬菌体的滴度损失在10-100倍范围内，噬菌体粉末的颗粒大小也控制在可吸入范围内(<5 μm)。冻干噬菌体粉末在控制相对湿度（RH为21.2%）的4℃或22℃条件下保存3个月，其稳定性良好，滴度降低可忽略不计。体外气雾剂试验显示，口喉下游采集到的噬菌体滴度在106 ~ 107 PFU之间，与吸入的噬菌体干粉相比，噬菌体KS4-M滴度损失为15.8倍、KZ滴度损失为6.3倍。
喷雾冷冻干燥是一种独特的干燥技术，它将喷雾干燥和冷冻干燥结合（即液滴形成、冷冻和升华），产生的干粉颗粒更符合空气动力学性质、便于肺部递送。Leung等人比较了喷雾干燥法和喷雾冷冻干燥法制备的噬菌体PEV2吸入粉末的体外稳定性，喷雾冷冻干燥法制备的噬菌体粉末在体外有更高的噬菌体回收率。喷雾冷冻干燥法也无法避免真空干燥下的噬菌体滴度损失，为解决这一问题，Ly和他们的团队研究了一种大气喷雾冷冻干燥（atmospheric spray freeze drying，ASFD）新技术，以开发噬菌体D29的固体干燥配方。在这个干燥过程中，噬菌体D29（存在不同浓度的海藻糖和甘露醇）被喷雾后在冷室中冷冻，随后冷干燥气体通过升华作用形成流动的粉末。结果表明，AFSD技术在海藻糖-甘露醇（质量比7:3）存在时，噬菌体最低滴度仅降低了3.9倍。
图4. 喷雾冷冻干燥法装置示意图
图片来源：Development of Biodegradable Polycation-Based Inhalable Dry Gene Powders by Spray Freeze Drying
在肺部给药的情况下，决定药物功效的另一个重要参数是肺部沉积率（最高剂量分数沉积在下气道即肺深部区域，而不是在口咽中），这不仅取决于所用的吸入装置，还取决于干粉在空气中分散的能力，即粉末分散性。细颗粒部分（fine particle fraction，FPF）代表颗粒尺寸小于上气道直径的比例，上气道直径固定为5 μm。为了提高FPF值，粉末更高的分散性是必要的。这是一个微妙的过程，因为微米大小的颗粒通常具有很强的内聚性和粘附性。赋形剂的使用可以使干粉颗粒更分散，但需要针对每种制剂进行优化，例如亮氨酸和三亮氨酸经常被用作喷雾干燥粉末的赋形剂。
3、结语
雾化和干粉吸入都是有效、安全的肺部给药方法，使噬菌体能够到达肺组织并靶向呼吸道病原菌。上文更多讨论了各方法的弊端，是以期望最大的临床效益，所以对每种噬菌体进行完整的优化研究，即使用哪种类型的雾化以及干粉吸入技术、稳定剂的选择、对噬菌体形态、稳定性和生存力的影响、肺沉积率等，都需要我们不断探究、优化。
注：本文原载于“上海噬菌体与耐药研究所”微信公众号，作者：李建辉。
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